DNA克隆服务

TA 克隆概述

TA 克隆载体即 T 载体，是目前克隆 PCR 产物最简便、快捷的方法。随着基因组计划的进行，以及分子生物学技术、基因芯片技术在生命科学研究、生物工程和医学等领域的应用，对 TA 载体的需求量会逐步扩大

TA 克隆方法（ Original TA Cloning Kit ）即利用 Taq 聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条 PCR 扩增产物的 3` 端自动添加一个 3`-A 突出端。利用 TaKaRa 的 T 载体，直接高效地连接 PCR 产物。 所以 TA 克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将 PCR 产物进行优化，不需把 PCR 产物做平端处理，不需在 PCR 扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。

原理如下：

• 价格 ：

PCR 产物长度  100 ～ 800  800 ～ 1600  1600 ～ 2500

价格  200 元 / 个  300 元 / 个  350 元 / 个

以上价格均包含二个测序反应的费用。

• 服务要求及保证 ：

• 如果需要我们克隆，请注明所克隆片段的名称，大小，以及使用什么 DNA 聚合酶进行扩增得到的 PCR 产物；

• 请在订单上务必注明 PCR 所用的两条引物的序列，以便我们在克隆结果出来时进行核对分析；

• 最后测序结果出来，证客户看到引物区序列以及对应的载体序列，我们的克隆即成功。

TA 克隆 常见问题分析及其解决方案

转化后无 克隆菌产生

可能的原因及建议：转化过程有问题或感受态细胞失活 可通过转化 pUC18/19 等未切割的可用于抗性筛选的质粒，检测感受态细胞的转化效率和转化操作是否正确

PCR 产物连接时白色菌落数很少或根本没有

可能的原因及建议：

•10× 快速连接缓冲 液稀释不当 提供的 T4 连接酶缓冲液为十倍浓度， 10μl 反应体积加 1μl T4 连接酶缓冲液；

•连接反应存在问题 连接缓冲液只有低的活性。 10× 快速连接缓冲液含有 ATP ，温度波动 ATP 易降解。使用一次性分装的缓冲液，避免其反复冻化；

•T 突出端丢失，引起载体平端连接，因而蓝色菌落数高于白色菌落数 避免核酸外切酶的引入，降解 T 突出端；

•连接孵育时间不够长。 连接过夜可得到理想结果；

•PCR 产物中含有抑制连接的成分，导致连接的失败 。将 PCR 产物和连接反应对照混合，观察是否存在抑制效应。如怀疑有抑制成分存在，应重新纯化PCR产物；

•PCR 产物没有 3 ‘‘‘‘‘‘‘‘-A 突出端，不能连接。 并非所有 DNA 聚合酶都产生 3‘‘‘‘‘‘‘‘-A 突出端，如 Pfu 酶的 PCR 产物为平端。平端 PCR 产物可先通过聚合酶及 dATP 进行加尾反应产生 3‘‘‘‘‘‘‘‘ -A 突出端，再与 T 载体连接 ；

•由于紫外灯过度照射形成嘧啶二聚体， PCR 产物不能连接；

•PCR 产物已经插入，但未破坏 lacZ 基因的翻译框；

•插入片段：载体连接比例不理想；

•连接的 PCR 片段中可能有引物二聚体；

PCR 产物质量太差。

•PCR 连接反应只产生白色克隆（没有蓝色克隆）

•氨苄失活，因而氨苄敏感菌可生长。 检查氨苄平板是正常制备并在一个月内使用菌株（如 TOP10 ）丧失 F‘‘‘‘‘‘‘‘ 因子 检测背景对照，如果菌落不是蓝色的，则可能是宿主菌细胞丢失 F‘‘‘‘‘‘‘‘ 因子（假设 acIqZ.M15 位于宿主菌的 F‘‘‘‘‘‘‘‘ 因子上，并使用正常平板）。用于 T- 载体系统的感受态细胞一定要正确制备；

•检查平板是否含有氨苄 /IPTG/X-Gal 以及是否新鲜。如平板有问题，重新制备新鲜平板 。