PCR产物直接测序有两大优点∶

一是操作易于标准化与自动化，因为它是一个单一的酶的反应过程，不依赖于生物体；

二是通过一次测序反应就能确定样品中某个等位基因的顺序，而PCR产物克隆后测序时，样品顺序要在测定了数个克隆片段之后才能确定。因为只有这样，才能区别突变是基因组本来就有的，还是由于Tag聚合酶在PCR过程中错误掺入核苷酸引起的。

PCR产物直接测序效果的好坏与其相关的每个步骤都有重要的关联，具体包括以下几个方面。

1　PCR反应条件的优化

PCR反应及PCR产物本身是会干扰测序反应的，有数点需要注意∶

①一条PCR产物通常较短小(＜1 000 bp)，两链很容易产生重退火现象，因此阻碍测序引物与DNA模板的退火，同时也会损害测序酶读序的能力；

②PCR反应中剩余的核苷酸可干扰测序反应。因为大量的未经反应的核苷酸带进测序反应中，打扰dNTPs/ddNTPs的比率，从而减少了ddNTPs的置入，最终减弱测序反应的信号；

③多余的PCR引物会与测序引物产生竞争，使测序反应信号减弱；④未经优化PCR反应会产生额外PCR条带，影响测序的结果。假如想增强信号，而去增加测序反应DNA的模板的量，即增加PCR产物的量，只会导致测序反应产生更多的“污染”，因此PCR产物会带来多余的核苷酸及PCR引物。所以一般pcr产物测序之前需要经过纯化试剂盒纯化PCR反应体系残留混合物（dNTP、引物和盐离子等）以后再测序。

PCR直接测序的效果与PCR扩增的特异性和制备测序模板所采用的方法有关，只有获得特异性高的PCR产物，才可获得准确度高、有效阅读测序长的结果。PCR的特异性可以通过摸索最佳循环参数和缓冲体系、重新设计寡聚核苷酸引物等方法加以提高。若扩增的片段是基因组DNA，将第一次扩增产物的低浓度稀释物进行第二次扩增，即可以有效地降低PCR产物测序产生的背景。

不管测序技术如何提高，各种测序方法的结果表明，起始与结束的一段序列(大概为20～30碱基)的准确度都较中间的序列低，因此为了得到最佳结果，片段应该大于200 bp；对于检测基因点突变的测序，则需将含有点突变的热点(hot spot)区段设计在测序结果最可靠的区域，即100～200碱基之间。

2　PCR产物的纯化

若扩增产物经凝胶电泳显示为一条整齐、细锐的带，即扩增特异性高时，可以过膜器纯化，或用成熟的PCR纯化试剂盒进行纯化；虽然只要限制PCR反应的核苷酸及引物的用量，或仅稀释PCR产物，PCR产物未经纯化可以直接测序，但经过常规性的PCR产物的纯化，一般都可以保证得到可靠的测序结果。若存在非特异性扩增产物，必须先经凝胶电泳，将PCR产物与引物、非特异性产物分离开来，切割下PCR产物带，然后可以通过沉淀方法纯化，根据多次实验的经验，此时最好还是继续优化PCR条件，不得已才采此下策。值得注意的是，所有的纯化方法在使用之前，必须证明该方法是切实可行的。

3　测序引物的设计

测序引物的设计总体原则和设计PCR引物相似，具体还有以下要求∶一般引物长度应至少比18个碱基长，以确保引物与模板较好的杂交，而且也减少了与载体或插入位点形成二级结构；避免引物中存在单个碱基的重复(例如超过3个或4个重复碱基，特别是G或C)；对于循环测序，引物Tm的值应该高于45℃，一般为50～65℃之间；引物G-C含量尽可能在40%～50%之间；引物与模板DNA应该完全结合；避免引物具有二级结构，或引物杂交形成二聚体。

在测序反应中，使用跟PCR反应中同一的引物，或许会有很好的结果。但是，最好使用内套引物，这会增加退火及测序反应的特异性。一般要求测序引物5′末端最少与PCR引物的3′末端距离20个碱基，这会增加反应的特异性，避免内套引物与其他PCR反应中的引物二聚体产生退火。另外也可加一个M13引物于特定引物末端，有助于测序，但如此则只有M13引物能用于测序。对于未知其序列的克隆片段，可用与载体多聚接头或其附近循序互补的寡聚核苷酸作为扩增引物。

值得注意的是PCR扩增引物不一定可用于测序，这是因为测序所用引物的结构条件比PCR用的严格，而且测序用引物纯度要比PCR用引物的要求高，所以，用PCR用引物扩增出来PCR的产物，在使用PCR用引物测序时，有测不出来的可能。

4　PCR产物直接测序的准确性问题

为了保证测序结果的特异性，在测序之前，应该把PCR产物和另一已定量的DNA样品（marker）同时进行电泳，就可知道该PCR产物的相对分子量大小、含量、纯度，并预测其在测序中的特异性。可以说模板的纯度和准确定量是取得好测序结果的关键。我们对PCR产物的浓度要求是50ng/ul,最低浓度不得小于30ng/ul,提供的量不少于20ul,已纯化的DNA样品必须溶于去离子水中，如果溶于TE缓冲液中的样品一般测序数据都会受到影响，严重时甚至导致测序反应失败。PCR产物纯度鉴定已电泳条带单一无拖带.杂带为准，对于存在引物二聚体的样品一定要选择胶纯化。

对于未知序列的测定以及基因的确定，仅一次实验的结果是不可信的，需多次重复才可确定。有文献报道，需从PCR制备测序样品这一步开始重复，而且要从不同的方向或同一方向、不同的测序化学反应类型进行测序，一般不主张同一方向或同一化学的重复。